?純化工藝通常分為澄清、捕獲和精細(xì)純化階段——但是隨著細(xì)胞培養(yǎng)密度的不斷提高，導(dǎo)致Protein A柱下游產(chǎn)品洗脫液中HCP和DNA含量的增加，此外，病毒滅活后的濁度上升都成為了精細(xì)純化階段面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。針對這些問題，本文介紹一種能夠解決Protein A柱純化效率的整體性方法，即采用新型復(fù)合澄清膜用于純化工藝中的澄清階段。

全球單抗市場銷售額在2017年超過1000億美元，2011～2017年的復(fù)合增長率為11.5%。今后為維持這一快速增長勢頭，生物制藥行業(yè)從研發(fā)到商業(yè)化生產(chǎn)需要新一代的單抗生產(chǎn)工藝。隨著細(xì)胞培養(yǎng)基及其表達(dá)工程體系的不斷發(fā)展，目標(biāo)產(chǎn)品表達(dá)量已達(dá)到15年前的10倍以上，對于一些難度較高的產(chǎn)品其表達(dá)量也取得了很大進(jìn)展，純化工藝則繼續(xù)依賴于傳統(tǒng)的工藝結(jié)構(gòu)。

目前的單抗純化工藝結(jié)構(gòu)大部分如圖1所示：

圖1 傳統(tǒng)的單抗純化工藝

Protein A由于其與抗體Fc片段良好的特異親和性，較高的純化倍數(shù)，工藝的簡易性而被用于大多數(shù)抗體純化工藝中的捕獲階段。然而，在提高細(xì)胞培養(yǎng)密度和延長培養(yǎng)周期從而顯著提高細(xì)胞表達(dá)量的同時，Protein A柱的純化效率也從產(chǎn)品純度99.9%降至98%～99%。此外，Protein A柱純化的穩(wěn)定性下降導(dǎo)致精細(xì)純化工藝更為繁瑣。目前，因病毒滅活導(dǎo)致料液濁度提高以及Protein A柱產(chǎn)品洗脫液中HCP和DNA含量的增加，使單抗純化工藝需要更為復(fù)雜的精細(xì)純化步驟和投入更多的成本。

這里我們介紹一種新型的單抗純化方法，它通過顯著加強(qiáng)Protein A柱的效率從而提高單抗純化工藝的性能表現(xiàn)，基本上能使Protein A產(chǎn)品洗脫液立即達(dá)到制藥級純度。

3M EmphazeTM AEX復(fù)合澄清膜用于澄清階段

關(guān)于Protein A柱性能變化的影響機(jī)制仍舊是非常熱門的研究話題，細(xì)胞發(fā)酵液中高濃度的聚集體被認(rèn)為是干擾Protein A柱純化效果的主要物質(zhì)，并在純化工藝的各個階段以導(dǎo)致聚集沉淀的媒介形式存在[1,2]。

為減少細(xì)胞發(fā)酵液中聚集體的含量，我們在澄清階段采用3M EmphazeTM AEX復(fù)合澄清膜來替換第二級精細(xì)深層過濾器。3M EmphazeTM AEX復(fù)合澄清膜是一款全合成產(chǎn)品，由高載量的Q-官能團(tuán)水凝膠介質(zhì)和0.2?μm 聚酰胺膜組成，能夠顯著降低細(xì)胞發(fā)酵液中的可溶性和不溶性雜質(zhì)。當(dāng)其用于澄清階段，可將細(xì)胞發(fā)酵液中DNA含量降低4 logs以上，通量大于400?L/m2。采用3M EmphazeTM AEX復(fù)合澄清膜用于澄清階段的純化工藝，及3M EmphazeTM AEX復(fù)合澄清膜結(jié)構(gòu)，分別見圖2，3。

圖2 采用3M EmphazeTM AEX復(fù)合澄清膜用于澄清階段的純化工藝

圖3 3M EmphazeTM AEX復(fù)合澄清膜結(jié)構(gòu)

具有層析機(jī)制的澄清解決方案

這里我們考察了將Zeta PlusTM粗級深層過濾（去除細(xì)胞）和3M EmphazeTM AEX復(fù)合澄清膜相結(jié)合應(yīng)用于澄清工藝階段的性能表現(xiàn)。該產(chǎn)品形式易于放大，適用于從實驗室到生產(chǎn)規(guī)模的整個工藝發(fā)展流程。圖4總結(jié)了該產(chǎn)品組合的澄清效果。從圖中可以看到澄清后的料液濁度持續(xù)保持在0.6?FTU。且澄清后料液易通過0.2?μm或0.1?μm過濾器，隨后經(jīng)Protein A柱純化。由于其獨特的結(jié)構(gòu)設(shè)計，3M EmphazeTM AEX復(fù)合澄清膜處理料液過程中其壓差幾乎沒有變化，出口料液濁度也維持穩(wěn)定。

圖4 AEX復(fù)合澄清膜對于DNA及HCP去除情況

AEX復(fù)合澄清膜也能夠顯著降低細(xì)胞發(fā)酵液中DNA和HCP的含量。

Protein A柱純化后產(chǎn)品純度

具有層析機(jī)制的澄清工藝顯著加強(qiáng)了Protein A柱的捕獲效率，并就HCP和DNA含量上來講，可獲得更高純度的產(chǎn)品。如圖5所示，對比了采用3M EmphazeTM AEX復(fù)合澄清膜與僅采用傳統(tǒng)深層過濾器用于澄清工藝對于Protein A洗脫液單抗純度的影響。結(jié)果非常明顯，結(jié)合具有層析機(jī)制的澄清工藝使Protein A柱洗脫液中產(chǎn)品純度就HCP和DNA含量來看可接近或達(dá)到注射級標(biāo)準(zhǔn)。

我們對該工藝的平臺化進(jìn)行測試，結(jié)果表明對4種不同單抗產(chǎn)品的純化結(jié)果非常相似。

圖5 四種不同單抗的DNA及HCP去除情況

總結(jié)

本文介紹了采用3M EmphazeTM AEX復(fù)合澄清膜用于澄清工藝的單抗純化新方法。當(dāng)其替換第二級精細(xì)深層過濾器時，細(xì)胞發(fā)酵液中DNA含量降低量>4 logs，并提高Protein A柱的純化效率，使Protein A洗脫液中產(chǎn)品純度達(dá)到或接近注射級標(biāo)準(zhǔn)。

這種工藝改進(jìn)的結(jié)果從根本上加強(qiáng)了工藝性能的表現(xiàn)，包括：

● 重建并簡化下游精細(xì)純化工藝；

● 若產(chǎn)品聚集體含量已足夠低的情況下，則可去除精細(xì)純化工藝和最終的病毒清除步驟。

該技術(shù)以其高穩(wěn)定性、可放大性和易于實現(xiàn)的特點，作為澄清工藝平臺的應(yīng)用極大地幫助單抗生產(chǎn)掃清障礙。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Gagnon.Emerging Challenges to Protein A

[P].BioProcess International, 2013.

[2] Gagnon et.Nonspecific interactions of chromatin with immunoglobulin G and protein A, and their impact on purification performance [P].Al, Journal of Chromatographic A, 2014.

文/葉璇

本文作者就職于3M中國有限公司。