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大家先看幾個耳熟能詳的數據：

每年有約400萬中國人死于吸煙引發疾病，超過因艾滋病、結核、交通事故及死亡的人數總和；

平均每6秒就有一個人死于吸煙有關疾病；

吸煙者的平均壽命要比不吸煙者縮短10年；

全世界每年因吸煙死亡人數高達700萬，其中89萬為常年吸食二手煙導致。

1究竟是什么讓吸煙如此有害健康？

吸煙者多死于肺癌，煙氣中常見的有害物苯并芘是一種高活性間接致癌物，屬于多環芳烴的一種。多環芳烴（簡稱PAHs）是人類較早發現的一類環境有機致癌化合物，廣泛存在于煙熏燒烤類食品、香煙煙霧中，通過呼吸道、消化道和皮膚進入人體，參與體內代謝，生成羥基多環芳烴（OH-PAHs）。香煙煙霧作為多環芳烴的一個重要來源，是吸煙者（包括吸二手煙者）接觸多環芳烴的主要途徑。

圖1 非吸煙者（左）與吸煙者（右）肺部對比圖

2如何檢測人體內的多環芳烴（PAHs）？

目前，尿液中的OH-PAHs是研究較多的人體對PAHs 的暴露水平綜合評價的生物標志物。但是尿液中多環芳烴代謝物的含量極低，且尿液成分較復雜，所含雜質可能對色譜柱造成損害，直接進樣不能滿足分析要求。而現有采用離線固相萃取技術來減少基質干擾，提高檢測靈敏度的方法，操作過程繁瑣費時，重現性較差，成本較高。

在線固相萃取（Online-SPE）是近年發展起來的一種全自動樣品前處理方式，具有富集純化一步完成、固相萃取柱可多次使用、重現性好、自動化程度高等優點，已被應用于食品、環境、生物等樣品中痕量有機物的檢測。

賽默飛與“國家生物監測”重點實驗室之一的上海疾病預防控制中心合作，開發了基于賽默飛雙三元液相色譜—在線SPE大體積進樣方法，實現人體尿液中多環芳烴羥基代謝產物的高靈敏度監測。

“國家人體生物監測項目”是國家衛生計生委疾控局組織的國家重大公共衛生服務項目，通過在全國開展現場流行病學調查和人體生物樣本中環境化合物檢測，獲得全國有代表性的環境化合物在人體內暴露負荷的基礎數據，為今后相關公共衛生工作提供支持。

本方法采用基于快速渦流色譜的Turboflow Cyclone 固相萃取柱對目標尿樣進行在線富集純化，將大分子蛋白雜質提前分離去除，不僅延長了固相萃取柱使用壽命，而且進一步降低了交叉污染率。同時，采用UHPLC-MS法，利用PAHs 專用細粒徑UHPLC色譜柱對多環芳烴代謝物實現快速分離，解決了常規液相分離中部分目標物的出峰無法徹底分開和無法準確定性定量的問題，結合大體積進樣，大大提高了檢測靈敏度。

圖2 在線SPE大體積進樣系統工作原理圖

【進樣富集】

【轉移】

【分析過程】

實驗條件

富集柱：Turboflow Cyclone柱（50×0.5 mm）；

分析柱：PAH UHPLC柱（2.1x100 mm，1.8 μm）；

柱溫30℃；進樣量2500 μL；

流動相A：水，B：甲醇:乙腈（1:1）；

梯度洗脫程序表1；質譜條件：負離子電噴霧（ESI-）。

表1 梯度洗脫程序表2  多環芳烴羥基代謝物的保留時間、檢測離子對和碰撞電壓注：帶“*”為定量離子對。

檢測結果

通過使用Turboflow Cyclone富集柱和1.8 μm UHPLC細徑分析柱（2.1x100 mm），12種目標化合物能夠在短時間內快速分離，混合標準溶液的總離子流圖見圖3。標準物質的實驗結果顯示方法線性范圍廣（0.002~1.0 μg/L），線性較好，且回收率高（90%~110%），各目標物在尿液中的檢出限較低可達到0.001 μg/L水平，各目標物的6次進樣結果RSD不超過5%，重復性較好。實驗采集了24個尿液樣本（9名兒童和15名成人，包括6名吸煙成人男性）進行分析，檢測結果顯示，吸煙者尿液中各種多環芳烴代謝物檢出量顯著高于非吸煙者（見表2）。圖3 各多環芳烴羥基代謝物標準溶液的總離子流圖表3  吸煙和非吸煙者尿液樣品中部分多環芳烴羥基代謝物測定結果

結論

本方法采用雙三元在線固相萃取前處理方法，大大簡化了樣品前處理過程，分析成本大為降低，樣品經固相萃取柱富集濃縮后在線轉移至分析柱進行分析，樣品中的待測組分能全部轉移至分析柱，樣品用量少且無損耗，采用質譜檢測器可獲得較高的靈敏度，可實現大批量樣品的自動、快速、高效檢測。

感謝上海疾病預防控制中心各位老師的辛勤工作，老師們用實驗數據再一次告訴我們：為健康，為家人，為自己，請拒絕吸煙！

關鍵詞：雙三元液相色譜；在線固相萃取；多環芳烴羥基代謝物；LC-MS

注：以上數據由上海疾病預防控制中心化學品毒性檢定所提供

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